為了讓EELISA試劑盒非常好的表現(xiàn)其作用，我們要注重ELISA測(cè)驗(yàn)盒的洗刷和保溫進(jìn)程，下面具體來(lái)看下。
ELISA試劑盒洗刷
按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的請(qǐng)求預(yù)備實(shí)驗(yàn)中需用的試劑。ELISA頂用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗刷的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液運(yùn)用pH計(jì)測(cè)量較正。從冰箱中取出的實(shí)驗(yàn)用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后運(yùn)用。
洗刷在ELISA進(jìn)程中雖不是一個(gè)反響進(jìn)程，但卻也決議著實(shí)驗(yàn)的成敗。ELISA測(cè)驗(yàn)盒即是靠洗刷來(lái)到達(dá)分離游離的和的酶符號(hào)物的意圖。通過(guò)洗刷以鏟除殘留在板孔中沒(méi)能與固相抗原或抗體的物質(zhì)，以及在反響進(jìn)程中非特異性地吸附于固相載體的攪擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗刷時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的攪擾物質(zhì)洗刷下來(lái)。可以說(shuō)在ELISA操作中，洗刷是zui主要的關(guān)鍵技術(shù)，應(yīng)引起操作者的高度注重，操作者應(yīng)嚴(yán)厲按請(qǐng)求洗刷，不得大意。
洗刷的辦法除某些ELISA儀器配有特別的主動(dòng)洗刷儀外，手工操作有浸泡式和流水沖刷式兩種，進(jìn)程如下：
1.浸泡式
a.吸干或甩干孔內(nèi)反響液;b.用洗刷液過(guò)洗一遍(將洗刷液注滿(mǎn)板孔后，即甩去);c.浸泡，行將洗刷液注滿(mǎn)板孔，放置1-2分鐘，間歇搖擺，浸泡時(shí)刻不行隨意縮短;d.吸干孔內(nèi)液體。吸干應(yīng)*，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清洗毛巾或吸水紙上拍干;e.重復(fù)操作c和d，洗刷3-4次(或按說(shuō)明規(guī)則)。在間接法中如本底較高，可增加洗刷次數(shù)或延伸浸泡時(shí)刻。
微量滴定板多選用浸泡式洗刷法。洗刷液多為含非離子型洗刷劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的是疏水性的，非離子型洗刷劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵，然后削弱蛋白質(zhì)與固相載體的，并借助于親水基團(tuán)和水分子的作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀況，然后脫離固相載體。洗刷液中的非離子型洗刷劑通常是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時(shí)，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低實(shí)驗(yàn)的靈敏度。
2.流水沖刷式
流水沖刷法開(kāi)始用于小珠載體的洗刷，洗刷液僅為蒸餾水乃至可用自來(lái)水。洗刷時(shí)附接一特別裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動(dòng)淋洗，繼續(xù)沖刷2分鐘后，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖刷式則比如淋浴，其洗刷作用更為*，且也簡(jiǎn)潔、敏捷。已有實(shí)驗(yàn)標(biāo)明，流水沖刷式相同也適用于微量滴定板的洗刷。洗刷時(shí)設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔外表，洗刷作用更佳。
ELISA試劑盒保溫
在ELISA試劑盒中通常有兩次抗原抗體反響，即加標(biāo)本和加酶物后?？乖贵w反響的完成需求有必定的溫度和時(shí)刻，這一保溫進(jìn)程稱(chēng)為溫育(incubation)，有人稱(chēng)之為孵育，在ELISA中似不恰當(dāng)。
ELISA屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的只在固相外表上發(fā)作。以抗體包被的夾心法為例，參加板孔中的標(biāo)本，其間的抗原并不是都有平等的和固相抗的時(shí)機(jī)，只要zui靠近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體觸摸。這是一個(gè)逐漸平衡的進(jìn)程，因而需經(jīng)擴(kuò)散才能到達(dá)反響的結(jié)尾。在其后參加的酶符號(hào)抗體與固相抗原的也相同如此。這即是為何ELISA反響總是需求必定時(shí)刻的溫育。
溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫文4℃(冰箱溫度)等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體的適宜溫度。ELISA試劑盒在樹(shù)立ELISA辦法作反響動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)標(biāo)明，兩次抗原抗體反響通常在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)品的生成可達(dá)高峰。為加快反響，可提高反響的溫度，有些實(shí)驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜選用更高的溫度?？乖贵w反響4℃更為*，在放射免疫測(cè)定中多使反響在冰箱中，以構(gòu)成zui多的沉積。但因所需時(shí)刻太長(zhǎng)，在ELISA中通常不予選用。
保溫的辦法除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，通常均選用水浴，可將ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底應(yīng)貼著水面，使溫度敏捷平衡。為防止蒸騰，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反響板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性杰出的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui終將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)則的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)分更應(yīng)如此。無(wú)論是水浴還是濕盒溫育，反響板均不宜疊放，以確保各板的溫度都能敏捷平衡。
ELISA試劑盒室溫溫育的反響，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)厲約束在規(guī)則的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書(shū)的請(qǐng)求操控溫育。室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可。應(yīng)留意溫育的溫度和時(shí)刻應(yīng)按規(guī)則力求。為確保這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。